矛頭蝮蛇血凝酶 止血藥

本品系從矛頭蝮蛇（Bothrops Atrox）蛇毒中提取的具有止血作用的蛋白酶類物質。每1mg中含矛頭蝮蛇血凝酶活力不得少于800單位，每1mg蛋白質中含矛頭蝮蛇血凝酶活力不得少于2500單位。

【制法要求】

本品系從檢驗合格的矛頭蝮蛇蛇毒（見附）中經透析、特異性親和色譜等多種色譜方法分離提取，並經冷凍干燥制得。生產過程應符合現行版《藥品生產質量管理規范》的要求。

【性狀】

本品為白色凍干塊狀物或粉末；無味。

本品在水中易溶。

【鑑別】

（1）取本品，加水溶解並稀釋制成每1ml中含100μg的溶液，作為供試品溶液；取小試管，加入凝血質控血漿混懸液［凝血質控血漿（MDC Hemostasis）放至室温，每支加水1.0ml，放置15分鍾，期間間或輕搖，每次使用前輕輕搖勻］0.2ml，置37℃±0.5℃水浴中2分鍾，加供試品溶液0.2ml，置37℃±0.5℃水浴中振搖，觀察，血漿應在10秒內出現白色絮團。

（2）取試管1支，加0.4mol/L碳酸鈉溶液1ml、鑑別（1）項下的供試品溶液1ml與0.1mol/L福林試液1ml，置37℃±0.5℃水浴中20分鍾，溶液應呈藍色。

（3）取本品與矛頭蝮蛇血凝酶對照品適量，分別加水溶解並制成適宜濃度的溶液，作為供試品溶液與對照品溶液，依法測定（通則3405第一法），供試品溶液的圖譜應與對照品溶液的圖譜一致。

（4）照電泳法（通則0541第五法，還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）測定。

取本品，加水溶解並稀釋制成每1ml中含蛋白質1mg的溶液，作為供試品儲備液；取此儲備液30μl，加還原型供試品緩衝液10μl，混勻，置沸水浴中加熱5分鍾，作為供試品溶液；取矛頭蝮蛇血凝酶對照品適量，同法制備對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液各15μl，分別加至上樣孔，分離膠濃度為12.5%，用考馬斯亮藍R250染色，供試品溶液主帶的遷移率應與對照品溶液主帶的遷移率一致。

【檢查】

純度　（1）照電泳法（通則0541第五法，非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）測定。

取鑑別（4）項下供試品儲備液30μl，加非還原型供試品緩衝液10μl，混勻，置沸水浴中加熱5分鍾，作為供試品溶液。取供試品溶液15μl，加至上樣孔，分離膠濃度為12.5%，用考馬斯亮藍R250染色，應顯示一條帶。

（2）照高效液相色譜法（通則0512）測定。

供試品溶液　取本品，加流動相A溶解並制成每1ml中約含蛋白質1mg的溶液。

色譜條件　用丁基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.1%三氟乙酸的0.1%三乙胺水溶液為流動相A，以0.1%三氟乙酸的0.1%三乙胺乙腈溶液為流動相B，按下表進行梯度洗脱；檢測波長為280nm；進樣體積50μl。

測定法　取供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

限度　按峰面積歸一化法計算，矛頭蝮蛇血凝酶主峰面積應不低于總峰面積的95.0%。

分子量　照電泳法（通則0541第五法，還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）測定。

取鑑別（4）項下的供試品溶液與分子量對照品溶液（系列標准蛋白質分子量范圍為10K～120K，照説明書使用），照鑑別（4）項下的方法測定。本品分子量應為36 000±3000。

磷脂酶A　照紫外-可見分光光度法（通則0401）測定。

供試品溶液　取本品，加水溶解並稀釋制成每1ml中含10單位的溶液。

對照溶液　取磷脂酶A（蜂毒），加水制成每1ml中含3.6單位的溶液。

測定法　取37℃預熱的卵磷脂溶液（取卵磷脂0.67g，加水適量，溶解成膠體溶液后，調節pH值至8.95，加水至100ml）2ml，置1cm吸收池中，加37℃水浴中預熱的供試品溶液或對照溶液1ml，混勻，以水代替供試品溶液，同法操作，作為空白。在546nm的波長處分別測定吸光度為A₁和A_S1，再于37℃±0.5℃水浴中保温10分鍾，分別測定吸光度為A₂和A_S2。

限度　供試品溶液吸光度增加值不得大于對照溶液吸光度增加值（即每1單位供試品中磷脂酶A含量不得大于0.36單位）。

單位定義：在37℃、pH 8.5條件下，每分鍾使1.0μmol的L-α-磷脂酰膽鹼（L-α-卵磷脂）水解成L-α-溶血磷脂膽鹼和一個脂肪酸的酶量定義為1單位。

L-氨基酸氧化酶　照紫外-可見分光光度法（通則0401）測定。

供試品溶液　取本品，加水溶解並稀釋制成每1ml中含10單位的溶液。

對照溶液　取L-氨基酸氧化酶（東部菱背響尾蛇），加水制成每1ml中含0.056單位的溶液。

測定法　取37℃預熱的亮氨酸溶液［取亮氨酸0.1g，3，3-二甲氧基聯苯胺6.5mg，加三羥甲基氨基甲烷-HCl緩衝液（取三羥甲基氨基甲烷1.21g，置燒杯中，加水60ml溶解，用6mol/L HCl溶液調節pH值至7.6，轉移至100ml量瓶中，用水稀釋至刻度）溶解並稀釋至100ml］2.97ml，置1cm吸收池中，加37℃預熱的過氧化物酶溶液（取過氧化物酶10mg，加水溶解至10ml，臨用時配制）10μl，分別加入供試品溶液或對照溶液20μl，混勻；以水代替供試品溶液，同法操作，作為空白。在436nm的波長處分別測定吸光度為A₁和A_S1，再于37℃±0.5℃水浴中保温5分鍾，分別測定吸光度為A₂和A_S2。

限度　供試品溶液吸光度增加值不得大于對照溶液吸光度增加值（即每1單位供試品中L-氨基酸氧化酶含量不得大于0.0056單位）。

單位定義：在37℃、pH 6.5條件下，每分鍾使1.0μmol的L-氨基酸氧化脱氨基的酶量定義為1單位。

磷酸酶　照紫外-可見分光光度法（通則0401）測定。

供試品溶液　取本品，加水溶解並稀釋制成每1ml中含10單位的溶液。

對照溶液　取磷酸酶（小麥胚），加水制成每1ml中含0.03單位的溶液。

測定法　取0.165%對硝基苯磷酸二鈉溶液（pH 8.5）1ml，分別加入供試品溶液或對照溶液0.1ml，置37℃±0.5℃水浴中保温30分鍾，再加0.02mol/L氫氧化鈉溶液10ml，搖勻；以水代替供試品溶液，同法操作，作為空白。在400nm的波長處分別測定吸光度。

限度　供試品溶液的吸光度不得大于對照溶液吸光度（即每1單位供試品中磷酸酶含量不得大于0.003單位）。

單位定義：在37℃、pH 4.8條件下，每分鍾水解1.0μmol的對硝基苯磷酸二鈉的酶量定義為1單位。

神經毒　取本品，加氯化鈉注射液溶解並稀釋制成每1 ml中含2單位的溶液，作為供試品溶液。取體重為300～500g的鴿子3只，每1kg體重注射供試品溶液0.5 ml，靜脈給藥，觀察24小時。動物不得出現神經行為異常，如步態不穩，翻正反射消失，前后肢握力減弱，抽搐，頸項強直等，或死亡；如3只鴿子中有一只出現上述神經行為異常或死亡，應另取鴿子5只復試，均不得出現神經行為異常或死亡。

出血毒　取本品，加氯化鈉注射液溶解並稀釋制成每1ml中含50單位的溶液，作為供試品溶液。取體重18～22g的小白鼠5只，每只一側背部皮下注射0.2ml，另一側注射氯化鈉注射液0.2ml作對照，注射24小時后處死動物，剝皮觀察，與對照部位相比，小鼠背部均不得有出血現象。

細菌內毒素　取本品，依法測定（通則1143），每1單位矛頭蝮蛇血凝酶中含內毒素的量應小于50EU。

異常毒性　取本品，加氯化鈉注射液溶解並稀釋制成每1ml中含1.0單位的溶液，依法測定（通則1141），按靜脈注射法給藥，應符合規定。

【效價測定】

酶活力　標准品溶液　取1支矛頭蝮蛇血凝酶標准品（供效價測定用），精密加水1ml使溶解並定量稀釋制成每1ml中各約含0.2、0.5、1.0、2.0、3.0單位的溶液。

供試品溶液　精密稱取本品適量，加水溶解並定量稀釋制成每1ml中約含1.0單位的溶液。

測定法　取凝血質控血漿混懸液［凝血質控血漿（MDC Hemostasis）放至室温，每支加水2.0ml，放置15分鍾，期間間或輕搖，每次使用前輕輕搖勻］0.1 ml，分別加入20支試管中並置凝血分析儀中，37℃±0.5°C條件下預熱2分鍾，精密量取系列濃度的標准品溶液各0.2ml，迅速加入上述各試樣管中，記錄凝固時間，每種濃度重復測定4次，計算平均值（4次測定最大值與最小值之差不得超過平均值的10%，否則重測）。以標准品溶液濃度的對數為橫坐標，凝固時間對數為縱坐標，計算線性回歸方程（相關系數應大于0.99）。

取供試品溶液，照上法測定，從回歸方程求得供試品溶液濃度，並計算每1mg中矛頭蝮蛇血凝酶活力。

矛頭蝮蛇血凝酶單位定義：37℃±0.5℃條件下，每0.2ml酶溶液使0.2ml凝血質控血漿混懸液，在58～62秒出現白色絮團的酶量，以酶溶液的濃度計，定義為每1ml酶溶液中含矛頭蝮蛇血凝酶1個單位。

蛋白質　取本品適量，精密稱定，照蛋白質含量測定法（通則0731第二法）測定，計算每1mg中蛋白質的量（mg）。

比活力　本品矛頭蝮蛇血凝酶活力單位除以蛋白質的量（mg），即得。

【類別】

止血藥。

【貯藏】

遮光，冷處保存。

【制劑】

注射用矛頭蝮蛇血凝酶

附：